馬三立祖籍甘肅省永昌，1914年生於北京，回族。他12歲跟父親馬德祿學藝，15歲從天津匯文中學初中畢業後，又拜著名相聲演員周德山（周蛤蟆）為師，專攻相聲。新中國成立前，馬三立在北平、天津的市場、商場及茶社、劇院撂地趕場說相聲，頗受歡迎。1953年他參加天津市曲藝團，1994年被聘為中國藝術研究院特約研究員。
2000年馬三立被確診為膀胱癌。「半年以來，爸爸一直住在天津總醫院，最近病情也是多次反覆」，今天早晨，記者在第一時間採訪到馬三立的長子馬志良先生，他告訴記者，他的父親馬三立由於呼吸和循環系統衰竭，今天早晨在親人的環繞中永遠地閉上了那張妙語連珠的嘴巴。按照伊斯蘭教的風俗，目前，馬老先生的遺體已經停放到當地清真寺。
馬三立在遺囑中說：「人總是要死的。我有一個最後的請求，就是在我過世後，請將我喪事從簡辦理，我不願讓各級組織再為我費心費神；同時我的朋友、學生和再傳弟子也比較多，所以不搞遺體告別，不接受花藍、花圈、輓聯，不接受錢物。我畢生只想把笑留給人民，而不能給大家添麻煩，給國家浪費錢財。我衷心祝願相聲繁榮，人民幸福，國家富強。
此致 馬三立鞠躬（蓋章）」
馬三立生前是我國相聲界年事最高的也是從藝時間最長的表演藝術家，為此他還榮獲了大世界吉尼斯之最的稱號，2001年12月8日，88歲高齡的馬三立還在從藝80週年暨告別舞臺晚會上以一段數板博得觀眾雷鳴般的掌聲。據馬志良先生介紹，一生奉行永遠「逗你玩」的馬三立在告別舞臺後也是三句話不離相聲，雖然老人平日少言寡語，只要開口大段說話，談的必然是相聲。
馬三立一生中演出的傳統相聲有200多個，留下了《吃元宵》、《賣挂票》、《黃鶴樓》、《相面》等膾炙人口的名段。他創作、改編並演出新的相聲節目六七十個，包括《買猴》、《十點鐘開始》、《偏方治病》等。多年來馬三立還培養了閻笑儒、班德貴、連笑昆、方笑天、常寶華、高笑林等許多相聲演員。
