【李修命专栏】中国科学家利用CRISPR/Cas9 技术基因编辑人类胚胎引争议

2015-04-27 03:12 作者: 李修命
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2001年,人类基因组工作草图发表,成为破译人类遗传信息的重要里程碑。雄心勃勃的人类基因组计划,与曼哈顿原子弹计划、阿波罗登月计划一起,并称为人类自然科学史上的三大计划。与前两个计划不同,人类基因组计划研究重点从制造原子弹和探索外太空转向了探究人类自身。当今的生物科技,特别是基因测试和DNA测序,已经产生了一系列急需讨论的生物伦理学议题。从克隆羊多利,到基因筛选,再到无癌宝宝,定制婴儿,科学的进步不断冲击人类的认知边界和道德底线。随着医学的进步,“设计婴儿”或21世纪版的优生学已引起科学家们的广泛关注。科学家认为通过调节人类基因组可以得到基因改造的完美婴儿。牛津大学人类未来研究院院长、哲学教授尼克·博斯特罗姆(Nick Bostrom)在其新书《超级智能》(Super Intelligence)中认为,基因是创造超级智商人类的关键。科学家预测未来人类可能拥有类似超人的认知能力:“人类将立刻具有天才般的能力、近乎完美的图像和语言能力、超快的思维和推理能力、强大的几何可视化能力、甚至更高的维度、执行多项分析或训练平行想象能力等。”

自从染色体在生命中所起的重要作用被发现以来,科学家们都一直梦想能够通过直接编辑基因进而从根本上治疗疾病。人体内已命名的基因共有25000多条,目前已知一部分基因(3000)的突变会引起各类疾病。对于此类疾病的治疗,最本质的手段是通过一些方法将突变后的遗传物质矫正回原来的状态。这类方法被称为遗传疗法(genetic therapies)。目前最广泛的遗传疗法手段为:1. 病毒载体感染方式引导的源基因导入;2. RNA干扰方式引导的目的基因表达下调。基因编辑技术(genome editing technologies)是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术,在疾病治疗方面的应用模式主要为:矫正/沉默有害突变,插入保护性突变,加入治疗性基因以及敲除病毒DNA。北海道大学的Tetsuya Ishii去年发表综述指出,近年来飞速发展的基因编辑技术(主要是CRISPR)非常简单很容易在生殖诊所中使用。Ishii最担心的是美国和中国。生殖细胞基因编辑在美国并没有被禁止,只是需要政府批准。中国虽然有相关禁令但执行起来可能并不容易,比如说用超声鉴定性别就没有完全被控制住。而且中国的灵长类基因编辑发展得最为迅速。

目前,基因组编辑有三大技术:CRISPR/Cas9TALENZFNZFNTALEN以及CRISPR/cas9核酸内切酶均能够特异性地识别与切割特定的DNA序列,引起DNA双链断裂(DSB)。CRISPR-Cas9基因组编辑技术是基于原核生物内源性的免疫反应。当原核生物遇到外源的核酸比如病毒基因组或者质粒的时候,一些原核生物把一部分很短的外源序列整合到自己的一个或者多个CRISPR位点,接着CRISPR位点被转录加工生成CRISPR RNAs (crRNAs)crRNA接着会引导DNA剪切酶Cas9根据序列互补的原则剪切未来入侵的外源核酸序列。此外CRISPR-Cas9还能精确地在指定位点引入外源核酸序列, 与传统的TALENZFN技术相比,CRISPR/Cas9系统更便捷、高效,应用也更广泛,目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。目前已发现三种不同类型的 CRISPR/Cas系统,存在于大约40%90%已测序的细菌和古菌中。其中第二型的组成较为简单,以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心的组成。由于其对DNA干扰(DNAi)的特性,目前被积极地应用于遗传工程中,作为基因体剪辑工具。

由于CRISPR/Cas技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具,能够完成RNA导向的DNA识别及编辑,为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台,受到众多科学家的追捧。2006年的诺贝尔奖获得者Craig Mello在接受美国国家公共电台采访时对CRISPR/Cas9赞不绝口;此外,在Cell杂志盘点的2013年度最佳论文中,CRISPR/Cas9也荣登榜单。一场围绕CRISPR-Cas9的专利大战也随之打响了,两个团队分别号称自己最先发明了这项技术。来自加州伯克利大学的Jennifer Doudna教授和德国亥姆霍兹医学研究中心的Emmanuelle Charpentier教授领导的合作小组最先在《科学》杂志上报道了利用CRISPR-Cas9进行基因组编辑的技术。他们正在申请一项专利,包含了该项技术在不同种类细胞中的大量应用的155项声明,同时他们声称该专利的优先日期是2012525号。而来自麻省理工(MIT)的张锋小组也利用CRISPR-Cas9在真核生物上进行了基因组编辑,张峰也申请了专利,专利的优先日期是在20121212号,更为重要的是,专利已经被批准发行了。 此后,和CRISPR-Cas9相关的专利如同雨后春笋般冒了出来,仅张锋这一个团队就已经获批了8项专利,都是通过"快速通道"获批,广泛涵盖了该项技术的各种应用。有些专利更是指向某些特定应用,比如有一项专利是专门针对CRISPR-Cas9技术在治疗亨廷顿舞蹈病上的应用。

CRISPR技术编辑人类胚胎有多容易呢?“任何掌握分子生物学技术和胚胎发育知识的科学家都能完成这项工作,”曾于2012年参与发现用CRISPR技术编辑基因的生物学家Jennifer Doudna说。哈佛医学院George Church的实验室里研究人员正在赋予大肠杆菌一些自然界从没有见过的基因。年轻的博士后Luhan Yang是一个来自北京的年轻人,是编辑CRISPR-Cas9基因技术的重要参与者。YangChurch一起创办了一家小公司,从事猪和牛的基因改造,加入优良基因,去掉劣质基因。号称聚集了众多世界一流生殖学博士的OvaScience生物技术公司也在致力于这方面的研究。这些研究团队的目标是,阐明有可能使儿童没有某些特定的会引起遗传病的基因。如果有可能纠正女性卵细胞或男性精子中的DNA,就可以在体外受精中用这样的生殖细胞生成一个胚胎,然后发育成一个婴儿。也有可能用CRISPR技术直接编辑早期发育阶段的体外受精胚胎的DNA。《MIT技术评论》采访的几位科学家说,在中国已经在进行这样的实验了,介绍基因改造后的胚胎发育状况的文章也即将发表。这些人不愿意公开自己的身份,因为这些文章还正在审核之中。这一切都意味着,生殖细胞基因改造研究的进展已经超过了所有人的想象。

Salk研究所的发育生物学家Juan Carlos Izpisua Belmonte正在用基因编辑技术去除线粒体的致病突变,他的研究对象是未受精的卵子。未来,经过线粒体修饰的人类卵子可能会用于IVF试管婴儿,防止后代从母亲那里遗传到线粒体疾病。近期MIT Technology review发表了一篇新闻报道,讨论了哈佛大学George Church实验室中中国留学生杨璐涵关于利用Cas9技术编辑人类生殖细胞的问题,文章发表之后获得广泛关注。杨璐涵作为第一作者在Nature Communication上发表Targeted and genome-wide sequencing reveal single nucleotide variations impacting specificity of Cas9 in human stem cells文章中阐明了可以通过对个人进行全基因组的深度测序分析从而进行更加个性化的Cas9位点设计,从而运用CRISPR技术的精确度。20154月中山大学基因工程教育部重点实验室研究人员Protein&Cell发表了他们的课题组利用CRISPR/Cas9系统对人类胚胎基因组改造的研究结果,有传言表示,目前中国至少有4个课题组在进行相关人类胚胎的研究,其中至少一个课题组在用正常人类胚胎或近似正常的人类胚胎进行研究。这一次的转基因人类胚胎研究,必将再次引发一段时间的争论。

中山大学的研究人员利用了一种“不能存活”的受精卵来进行研究。这种受精卵含有一个卵细胞和两个精子的三个细胞核,从而不能正常发育成婴儿。研究人员利用最近很火的CRISPR/Cas9系统来剪切受精卵中人的HBB基因(β-globin gene),因为HBB基因突变会导致β地中海贫血症。他们注射了86个三核受精卵,其中71个受精卵存活。在做检测的54个样品中,有28个受精卵的HBB被剪切了,而其中只有更小一部分被重组修饰了。不仅如此,非靶向的突变也出现了。研究人员就认为目前这种技术在胚胎上应用的效率太低太不成熟了。非靶向突变的出现也说明这一技术存在一定的问题,因为这些非靶向的突变通常都是有害的如果做全基因组测序会发现更多的非靶向基因被修饰了。如果想在医学上应用CRISPR/Cas9技术,还需要改进该技术的准确性和保真性。研究人员计划利用成体细胞或者动物模型来继续研究,通过不同的策略来减少非靶向突变另外也可以考虑其他基因编辑技术,比如TALEN技术。

这篇文章被NatureScience拒稿的部分原因都是伦理问题。生殖细胞基因编辑(改造胚胎、卵子或精子)一直是人们关注的额角点,因为这样的遗传学改变会代代相传影响后代。一些人认为基因编辑胚胎研究具有光明的未来,因为它能在孩子出生之前来消除严重的遗传性疾病。而另一些人认为这种研究跨越了伦理底线,因为这种胚胎修饰是可遗传的,可能会对未来带来意想不到的后果。还有人担心,因为这种技术的简单易操作,会有人进行不安全或者不道德的应用。美国再生医学联盟的主席Edward Lanphier联合四位学者在三月十二日的Nature杂志上发表评论“不要编辑人类生殖细胞”。文章号召研究者们暂时不要对人类生殖细胞进行基因编辑。因为用现有技术对人类胚胎进行基因编辑,可能对后代产生无法预测的后果。“这样的技术可能被利用,进行非治疗性的基因编辑。我们担心这样的伦理问题会引起公众抗议,影响基因编辑技术在医疗领域的美好前景”“我们需要停下任何涉及人类胚胎的生殖细胞基因编辑”

CRISPR/Cas9技术的发明人之一加州大学的生化学家Jennifer Doudna也和其他作者一起发文呼吁全球应该暂停这种技术的应用,从而给科学家,伦理学家和大众时间来了解。Jennifer Doudna认为,基因编辑技术在医疗上的每一个应用,都需要分别验证其安全性和有效性。20151月,20多位科学家、伦理学家和法律专家来到了加州的Napa谷,在葡萄园里度假。他们是发现了如何用CRISPR技术编辑基因的伯克利科学家Doudna召集来的。她已经意识到,也开始担忧,有些科学家会迫不及待地用这种方法来对生殖细胞进行基因改造。现在她想知道,他们是否可以停止。Doudna说,“作为科学家,我们都知道CRISPR技术非常强大。但是事情都有两面性。我们必须确保它能够得到谨慎的应用。在应用于人类生殖细胞编辑的时候尤其要注意。”在1975年的Asilomar会议上,生物学家就如何安全地处理重组的DNA达成了共识。那么在Napa的这次聚会中Doudna希望如此。Doudna认为,不仅应该暂停关于改造胚胎的研究,还应该暂停利用CRISPR技术改变人类精子和卵子的研究。她说,“我认为这样的实验是不恰当的。我觉得现在需要的研究是了解这种技术的安全性、有效性和有关分娩的知识。我认为可以在人类以外的动物身上进行这样的实验。”

来源:看中国

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